1. Itaconate activates Nrf2
在LPS-treated human macrophages中，衣康酸的丰度显著升高 (a)，小鼠BMDM在LPS刺激后，衣康酸也显著升高，达到了5 mM (b, c)。衣康酸含有一个亲电子的α,β不饱和羧酸，使其具有通过Michael addition来烷基化蛋白的半胱氨酸残基，形成 2,3-dicarboxypropyl adduct。而其可能进行半胱氨酸烷基化的底物就是抗氧化反应中的核心分子KEAP1 (d)(WHY?)。NRF2的烷基化失活使得其可以Nrf2聚集，并发挥抗氧化抗炎作用，因此作者检测了KEAP2和NRF2是否是衣康酸的下游靶点。
Michael addition (迈克尔加成)：是指碳负离子（亲核的负碳离子，电子给体）对 α、β-不饱和醛 、酮 、羧酸 、酯、腈、硝基化合物等（亲电的共轭体系，电子受体）的共轭加成反应，该反应是一类十分重要的有机反应。在有机合成上用以增长碳链，合成带有各种官能团的有机化合物。为最有价值的有机合成反应之一，是构筑碳-碳键的最常用方法之一。有时也称为1，4-加成、共轭加成。是亲核试剂对α，β-不饱和羰基化合物发生的β位碳原子发生的加成反应，在逆合成分析中属于亲核试剂对a3合成子发生的反应。
Kelch样ECH关联蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)是E3泛素连接酶的底物识别亚单位,在蛋白质的泛素化修饰中起重要作用。 蛋白质的泛素化修饰作为一种重要且复杂的蛋白质翻译后修饰,在自噬和蛋白酶体系统中作为降解信号而被利用。
Nrf2是一种对氧化应激高度敏感的转录因子,在正常生理状态下,与其负调控蛋白Keap1结合,通过泛素-蛋白酶体系统被泛素化和降解。氧化应激导致Nrf2与Keap1解离，Nrf2转位到细胞核内，与小Maf(sMaf)蛋白形成异二聚体并识别ARE序列，启动下游目标基因的转录，发挥广泛的抗氧化抗炎作用。由于Nrf2处于复杂调控网络的中心,其活性受到多个水平的严格调控,包括转录及转录后调控、蛋白质稳定性调控、亚细胞定位调控和翻译后修饰调控等（详见文章末尾）。
衣康酸的类似物—4OI可以上调Nrf2的表达(e)，并且上调其下游靶基因，包括抗炎蛋白Hmox1的表达(f, g)。而且4OI对Nrf2的激活效果比临床上使用的Nrf2 activator DMF的效果更好(h)。
Nrf2的靶基因：Nqo1，Gclm，Gsr，Homox1，Pdg，Taldo。
2. Itaconate alkylates cysteines
衣康酸由IRG1在线粒体基质产生，必须跨过线粒体内膜才可以在胞浆中影响Nrf2。衣康酸在结构上与苹果酸类似，可以通过二羧酸dicarboxylate, 柠檬酸citrate 和 氧化戊二酸carriers穿过线粒体内膜。实验结果显示，这三个carrier都可以转运衣康酸，而其他转运体则不能(a)。这个结果提示衣康酸在生成之后通过这些转运体进入胞浆活化Nrf2。
作者的猜想是衣康酸活化Nrf2是通过烷基化KEAP1的半胱氨酸残基（类似于延胡索酸对半胱氨酸的修饰）。半胱氨酸151 (Cys151)是KEAP1应对sulforaphane和DMF的主要sensor。与sulforaphane相似，在共表达wild-type KEAP1 而不是 Cys151Ser mutant的COS1细胞中，OI 可以stabilize V5-tagged Nrf2 (Nrf2–V5) (b)。为了直接分析KEAP1的烷基化，作者在HEK293T细胞中过表达了Myc-DDK-tagged KEAP1，并使用OI干预。对免疫沉淀的KEAP1进行串联质谱结果显示，OI处理将其质量增加了242.15Da，与OI引起的烷基化相一致(c)。此外，在LPS处理的BMDM中，衣康酸的半胱氨酸残基部分来源于葡萄糖和谷氨酰胺(d)。These data suggest that itaconate activates Nrf2 by alkylating KEAP1 cysteine residues。此外，LDHA (糖酵解的关键调节分子) 在OI和LPS处理的巨噬细胞中也被烷基化了(e)。This modification, here defined as 2,3-dicarboxypropylation, generates a stable thioether. As there are no known pathways for the removal of such post-translational modifications, modified proteins are probably degraded, suggesting that this modification will have profound effects on macrophage function. ?
3. OI limits IL-1β in an Nrf2-dependent manner and protects against LPS lethality
接着作者探究了衣康酸活化Nrf2是否可以抗炎。在BMDM中使用不影响细胞活性的OI，显著降低了LPS诱导的Il1b的mRNA, pro-IL-1b, HIF-1a和IL10的蛋白水平(a, b)。OI还可以阻断TLR2和TLR3激动剂干预的BMDM的IL1B表达(附图)。LPS诱导的ROS和iNOS在OI处理后也下降(c, d)。在人的外周血PBMC中OI也抑制了LPS诱导的IL1B的表达（e）。OI降低了lps诱导的脓毒症小鼠的死亡率，降低了临床评分，改善了体温调节，降低了IL1B和TNF而不是IL10的表达(f-g)。而在Nrf2缺陷的巨噬细胞中，OI诱导HMOX1表达的能力下降，其降低LPS诱导的细胞因子的能力也下降(h)。而再加入Nrf2的激活剂可以挽救上述效应(附件)。
4. A feedback loop exists between itaconate and IFN-β
We next investigated how switching from a pro- to an anti-inflammatory state might affect itaconate production from aconitate by IRG1.
此前一篇基因调控网络推断的文献报道，Irg1的表达受IRF1的调控(一篇plos one)。在这里，作者发现IFN-β处理可以增加衣康酸的水平(a)。同时，Irg1的底物，柠檬酸和乌头酸的水平下降。IFN-β处理可以增加基础和LPS处理下的Irg1表达(b)。而敲除Irg1后，LPS和Poly(I:C)诱导Irg1的表达能力下降(c)，提示自分泌的IFN可以促进IRG1的产生。而OI可以抑制IFN反应，降低IFN-β, IKK-ε, ISG20 和ISG15蛋白的表达 (d-g)。
h: These data suggest the operation of a negative-feedback loop: itaconate is generated in response to LPS, in part through type I IFNs, and promotes an anti-inflammatory program by Nrf2 activation, as well as SDH inhibition. This limits further inflammatory gene expression and its own production by downregulating the IFN response. This helps to explain why Nrf2-deficient mice are more sensitive to septic shock, even though under certain circumstances these mice are protected from inflammation. Our identification of itaconate as an inflammatory regulator, that directly modifies proteins through a newly identified post-translational modification, unveils therapeutic opportunities to use itaconate or OI to treat inflammatory diseases.Furthermore, an intriguing link was recently made from itaconate to
vitamin B12, and this warrants further investigation in the context of inflammation and immunity. Further understanding the role of itaconate as an anti-inflammatory metabolite and regulator of type I IFNs is likely to yield new insights into the pathogenesis of inflammatory diseases.
其他知识点：
- Nrf2功能及信号通路
Nrf2是一个对于氧化应激反应非常重要的转录因子，它会结合在位于许多细胞保护基因启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）上。
在正常情况下，Nrf2会被BCR（KEAP1）复合体泛素化修饰并在细胞质中降解。
在氧化应激反应中，亲电子代谢物会抑制BCR（KEAP1）复合体活性，促进NFE2L2/Nrf2与一类小的Maf蛋白形成异二聚体，在细胞核内发生聚集现象。
Nrf2也会通过调节β-珠蛋白增强子活性参与β-珠蛋白簇基因的转录激活。
应激条件如接触到毒素/ROS、致癌信号、基因突变、自噬干扰、代谢变化等会破坏KEAP1-Nrf2复合物并导致Nrf2被激活。激活后的Nrf2在细胞核中积累，并与其他转录因子、辅因子互作，调控靶基因的转录。Nrf2的活性受多水平调控，包括转录调控（NF-κB，AhR-ARNT，ATF4等）、转录后调控（miRNA，RNA结合蛋白，可变剪切）、翻译后调控（ERK，JNK，PKC，CK2，PERK，GSK3，p38）、自身稳定性调控（KEAP1，βTrCP，HRD1，WDR23， CRIF1）。
Modulating NRF2 in disease: Timing is everything
Nrf2与 小Maf 蛋白形成异二聚体后能够有效结合ARE / EpRE（抗氧化反应元件/亲电子反应元件），启动下游靶基因的转录。这些靶基因会参与蛋白酶体组装、自噬、预防细胞凋亡、维持氧化还原平衡、脂质和碳水化合物代谢、血红素代谢、铁稳态、药物/异生物质代谢、其他转录因子的转录调控和 DNA 修复（图9）。
正常情况下，Nrf2定位于胞质；在氧化应激反应，亲电试剂，化学激活剂刺激下，Nrf2在细胞核中聚集。
Modulating NRF2 in disease: Timing is everything
延伸：Nrf2 信号通路丨蛋白请就位，Nrf2 的“戏精”之路
