一、实验目的

细菌培养用于后续的细胞感染、动物感染、以及转化、蛋白提取、质粒提取等实验。

二、实验步骤(protocol)

(一)灭菌<必要的实验前准备>

1.常用灭菌方法:

    ①干热灭菌法:适用于玻璃材质的器皿。用称量纸与细菌培养的专用封口膜将试管口封住，于160℃灭菌2h；

   ②高温高压灭菌法:适用于塑料材质的器皿。在灭菌锅中进行，若对玻斑璃器皿进行灭菌，则会产生冷凝水，灭菌完毕后，宜置于60°C烘箱烘干。灭菌锅参数:121℃，30min。

2.需灭菌的器材:试管、培养皿、玻璃涂布棒、枪头盒。

(二) LB培养基配制  

1.根据说明书配方配制LB培养基(液态)与氨苄青霉素LB琼脂培养平板(固态),注意 PH调节。

2.参考配方:将胰蛋白胨 10g、酵母提取物5 g、NaCl 10g加入800mL去离水中，摇动容器直至溶质溶解，调PH至7.0，用去离子水定容至1000mL。高压蒸汽灭菌，冷冻保存(-20℃)备用。注意盛放液体培养基的锥形瓶内液面≤2/3（三分之二）

3.氨苄青霉素LB琼脂培养平板的制备

将琼脂粉1.5g加入100mL LB培养基中，高压灭菌，振摇使瓶内琼脂完全溶解，冷至40~50°C后，无菌条件下向并内加入50mg/mL氨苄青霉素100μL，超净台上将其倒入10mm的培养平皿中，一般倒15~20mL即可，室温下冷至琼脂凝固。

(三)菌种复苏

    拿到新的菌株时，注意鉴定是否含有杂菌，鉴定方法有：

    ①传统方法：用接种环将菌涂在玻璃薄片上，然后镜检细菌型态，参照文献记录和或说明书进行比对判断(菌液一定要稀释后再涂布染色,避免菌太密集

    ②全新方法：涂布固体培养皿，判断生长的是否是单一菌落，若察觉异常，则需要进行测序鉴定，挑一个单菌落，放在PBS或生理盐水的缓冲液中，送到测序公司测序，检定该菌是否是待培养的细菌，若鉴定结果是待培养菌则可进行细菌的扩大培养。

(四)细菌的扩大培养

1.细菌扩大培养可在液态培养基或固体培养基中进行菌液的室温融化即可。

2.单一菌落经稀释后放入液态培养基中,37℃恒温摇床120rpm摇菌（一般1：1000比例加入氨苄青霉素），不要过夜摇菌，可放在4℃冰箱保存。(细菌稀释经验推荐：稀释比例5%即| mL菌液加到20ml液态培养基)。

3.玻璃涂布捧在采菌时，先在酒精灯的火焰上烧一下，记住烧出的黑色物质需要去除后方能使用，然后把细菌用玻璃涂布捧涂在固态培养基上，37°C孵箱倒置培养。

(五)细菌的冻存

    将40%甘油与菌液以1：1体积比混合,即最终甘油浓度为20%。冻存用的菌液浓度宜高，避免冻存过程中的损耗。

(六)细菌的定量

   1.经验参数法：酶标仪检测菌液0D600nm,若D600mm≈0.4,则说明细菌数量约为5x10E8个

   2.逐级稀释法：不同菌株的经验参数值略有差异，因此首次对某一菌株进行定量时，应采用4000rpm，离心20min，收集菌液，取0.1mL菌液添加到9.9mLPBS/生理盐水中,得到1/100稀释比率溶液，经过3次稀释，最后一管的样品的最终稀释率为：1/1000000。

然后向固体培养基上涂布0.1mL的1/10E-6稀释液，生长的单菌落数为n个,则最初的样本中的细菌数为nx10E8个，计数方法如下:

    细菌数/mL=(最终平板菌落数/稀释率)÷涂布体积=(n/10E-6)÷01 mL=nx10E8 mL。